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北大魯鳳民教授：用CRISPR/Cas9治療乙肝
（圖片源于百度）
論文的通訊作者是北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病原生物學(xué)系魯鳳民（Feng-Min Lu）教授。其主要從事病毒性肝炎的實(shí)驗室診斷、HBV感染相關(guān)肝癌發(fā)病機(jī)制等研究。在病毒性肝炎研究方面曾獲國家科技進(jìn)步二等獎一次。在包括New England Journal of Medicine、Cancer Research、American Journal of Human Genetics、Cancer Cell等雜志共發(fā)表SCI收錄研究論文約50篇。
盡管可獲得預(yù)防性疫苗，乙型肝炎病毒（HBV）感染仍然是全球一個重要的公共健康問題。由于HBV共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）儲存庫持續(xù)存在于肝細(xì)胞的細(xì)胞核中，當(dāng)前的抗病毒藥物，包括核苷類似物（NAs）和干擾素（IFN）都只能控制HBV生成，卻無法清除HBV。NAs不能影響cccDNA，因此停止抗病毒治療的患者乙肝常常會再度復(fù)發(fā)。此外，由于HBV cccDNA的穩(wěn)定性非常高而降解緩慢，因此需要終身治療慢性乙肝。另一方面，雖然在胞嘧啶脫氨和脫嘌呤/無嘧啶位點(diǎn)形成后IFN-α可以降解cccDNA，并進(jìn)一步清除某些患者體內(nèi)的病毒，其療效尚不能令人滿意。除去cccDNA是臨床治愈慢性乙肝的唯一途徑，也是慢性乙型治療中一個仍有待解決的問題。
CRISPR/Cas9系統(tǒng)是源自細(xì)菌和古細(xì)菌適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的一種新型基因組編輯工具。CRISPR/Cas9系統(tǒng)可誘導(dǎo)靶基因組位點(diǎn)發(fā)生雙鏈斷裂（DSB）來促進(jìn)基因組編輯。在缺乏修復(fù)模板時，DSBs是通過非同源末端連接（NHEJ）過程重新連接，這可以導(dǎo)致插入/缺失（indel）突變。研究人員已不僅成功應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)基因組編輯，還利用其破壞了病毒包括腺病毒、單純皰疹病毒（HSV）和人類免疫缺陷病毒（HIV）的基因組。就HBV來說，研究證實(shí)CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以有效切割HBV A和D基因型的表達(dá)模板，A， B， C， D基因型是東亞及世界其他地區(qū)HBV主要的基因型，因此必須要設(shè)計出HBV A-D基因型特異性的向?qū)NAs （gRNAs）。
在這篇文章中研究人員評估了CRISPR/Cas9系統(tǒng)清除HBV A-D基因型的基因組的潛力。他們總共設(shè)計出了對抗HBV A-D基因型的15種gRNAs。選出了覆蓋HBV調(diào)控區(qū)域的11個雙gRNAs組合。通過測量HBV表面抗原（HBsAg）或培養(yǎng)物上清液中的E抗原（HBeAg）檢測了每種gRNA和11個雙gRNAs抑制HBV（A-D基因型）復(fù)制的效力。利用PCR和測序方法檢測了在共轉(zhuǎn)染雙gRNAs和HBV表達(dá)載體的HuH7細(xì)胞中HBV表達(dá)載體的破壞情況。并利用KCl沉淀、PSAD消化、滾環(huán)擴(kuò)增結(jié)合定量PCR的方法在HepAD38細(xì)胞中檢測了cccDNA的破壞情況。并評估了這些gRNAs的細(xì)胞毒性。
結(jié)果顯示所有g(shù)RNAs都可以顯著減少培養(yǎng)物上清液中HBsAg或HBeAg生成，這取決于gRNA對抗的區(qū)域。所有的雙gRNAs都可以有效的抑制HBV A-D基因型生成HBsAg和/或HBeAg，與單gRNA相比，雙gRNAs抑制HBsAg和/或HBeAg生成的效力大大提高。此外，通過PCR直接測序技術(shù)，他們證實(shí)了這些雙gRNAs可通過除去兩gRNAs切割位點(diǎn)之間的片段來破壞HBV表達(dá)模板。更重要的是，gRNA-5和gRNA-12組合不僅可以有效抑制HBsAg和/或HBeAg生成，還能夠破壞HepAD38細(xì)胞中的cccDNA儲存庫。
這些結(jié)果表明了，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以有效破壞HBV表達(dá)模板，且沒有明顯的細(xì)胞毒性。它有可能是在慢性HBV感染患者中根除持續(xù)存在的HBV cccDNA的一種潛在的方法。
(來源：生物通)
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